01Čo je to
LL-37 je jediný katelicidín človeka: 37-aminokyselinový amfipatický peptid, ktorý sa odštiepuje z C-konca prekurzora hCAP18, produktu génu CAMP. Vzniká v neutrofiloch a v epiteli kože, dýchacích ciest, čreva a semenníkov, aj v monocytoch, T-lymfocytoch, NK-bunkách a B-lymfocytoch, a vylučuje sa do tekutiny rán a povrchu dýchacích ciest. Jeho názov hovorí o dvoch leucínoch na začiatku sekvencie a o 37 zvyškoch.
V tele plní dve úlohy naraz. Priamo poškodzuje membrány mikróbov a zároveň mení signály hostiteľských buniek: priťahuje bunky imunitného systému do miesta poranenia alebo infekcie, viaže a neutralizuje lipopolysacharid, podporuje novotvorbu ciev a uzatváranie rán. Ako liek sa vyvíja pod názvom ropokamptid (Promore Pharma) vo forme roztoku na kožu a prešiel štúdiou prvého podania človeku aj štúdiou fázy 2b pri bércových vredoch; pri syndróme diabetickej nohy skúmala krém s LL-37 samostatná randomizovaná štúdia v Jakarte.
02Mechanizmus účinku
Antimikrobiálny účinok LL-37 závisí od jeho priestorovej štruktúry. V čistej vode je peptid neusporiadaný, v prítomnosti hydrogénuhličitanu, sulfátu alebo trifluóracetátu zaujme helikálnu konformáciu a s podielom alfa-helixu rastie jeho účinnosť proti grampozitívnym aj gramnegatívnym baktériám. V zložení iónov plazmy, intracelulárnej aj intersticiálnej tekutiny je helikálny; minimálna inhibičná koncentrácia proti Escherichia coli je 5 µM. V prítomnosti ľudského séra sa jeho antibakteriálna aj cytotoxická aktivita tlmí.
Tvorbu peptidu riadi vitamín D. Gén CAMP je priamym cieľom receptora vitamínu D: 1,25-dihydroxyvitamín D3 a jeho analógy zvyšujú jeho expresiu v myeloidných líniách, v keratinocytoch, v makrofágoch z ľudskej kostnej drene aj v nádorových líniách hrubého čreva, a to cez konsenzusový vitamín-D-responzívny element v promótore. Aktivácia Toll-like receptorov v ľudských makrofágoch zvyšuje expresiu receptora vitamínu D aj 1-hydroxylázy, čím indukuje katelicidín a ničí vnútrobunkové Mycobacterium tuberculosis; sérum s nízkym 25-hydroxyvitamínom D túto indukciu mRNA katelicidínu podporovalo slabo.
Pri hojení pôsobí LL-37 na keratinocyty cez receptor epidermálneho rastového faktora. V ľudských keratinocytoch vyvolal 1 µg/ml peptidu maximálnu migráciu v Boydenovej komore a do 10 minút fosforyloval EGFR; inhibítory jednotlivých krokov transaktivácie (OSU8-1, CRM197, protilátka proti EGFR a AG1478) migráciu úplne zablokovali, rovnako ako dominantne negatívny STAT3. V ľudskej línii HaCaT aktivuje LL-37 aj dráhy MAP-kináz a PI3K/Akt, transkripčné faktory Snail a Slug a matrixové metaloproteinázy a indukuje receptor FPRL-1.
LL-37 je zároveň angiogénny. Cez receptor FPRL-1 na endotelových bunkách zvyšuje ich delenie a tvorbu cievnych štruktúr, vyvolal novotvorbu ciev v teste na chorioalantoickej membráne a v králičom modeli ischémie zadnej končatiny; u myší bez CRAMP, myšieho homológu LL-37, je vaskularizácia hojacej sa rany znížená. V ľudskej koži stúpa hladina hCAP18 po poranení s maximom 48 hodín po úraze a po uzatvorení rany sa vracia na pôvodné hodnoty; v epiteli okraja chronických vredov hCAP18 chýba a v modeli organovo kultivovanej ľudskej kože protilátky proti LL-37 reepitelizáciu tlmia v závislosti od koncentrácie.
03Účinky
Pri chronických vredoch dolných končatín zrýchľuje LL-37 hojenie. V štúdii prvého podania človeku s 34 pacientmi s obtiažne sa hojacimi bércovými vredmi nasledovalo po trojtýždňovej otvorenej fáze s placebom štvortýždňové dvojito zaslepené podávanie LL-37 v koncentráciách 0,5, 1,6 alebo 3,2 mg/ml dvakrát týždenne. Konstanty rýchlosti hojenia boli pri 0,5 mg/ml približne šesťnásobne a pri 1,6 mg/ml trojnásobne vyššie než pri placebe (p = 0,003 a p = 0,088) a priemerná plocha vredu sa zmenšila o 68 %, respektíve 50 %; pri najvyššej koncentrácii sa hojenie od placeba nelíšilo.
V štúdii fázy 2b so 148 pacientmi s obtiažne sa hojacimi bércovými vredmi (priemerný vek 67,6 roka, medián trvania vredu 20,3 mesiaca, priemerná plocha 11,6 cm²) sa LL-37 v koncentráciách 0,5 a 1,6 mg/ml pridával ku kompresnej liečbe. V celej populácii sa rýchlosť hojenia oproti placebu nezmenila, kým v následnej analýze podskupiny s vredom od 10 cm² — čo je známy nepriaznivý prognostický faktor — bolo zlepšenie v niekoľkých prepojených ukazovateľoch hojenia štatisticky významné. Liek bol v oboch koncentráciách dobre znášaný.
Pri syndróme diabetickej nohy s miernou infekciou porovnávala randomizovaná dvojito zaslepená štúdia v Jakarte krém s LL-37 s placebom dvakrát týždenne počas štyroch týždňov. Východisková hladina LL-37 v tekutine rany bola v oboch skupinách nízka (medián 1,07, respektíve 1,11 ng/mg bielkoviny) a nárast indexu granulácie bol v skupine s LL-37 vyšší na 7., 14., 21. aj 28. deň (p = 0,031; 0,009; 0,006 a 0,037). Hladiny interleukínu 1α a TNF-α krém neznížil — na 14. a 21. deň stúpli v oboch skupinách — a počet aeróbnych bakteriálnych kolónií sa medzi skupinami významne nelíšil.
Význam peptidu pre ľudskú obranu ukazujú aj stavy s jeho nedostatkom a nadbytkom. U šiestich pacientov s Kostmannovým syndrómom, ťažkou kongenitálnou neutropéniou liečenou rastovým faktorom G-CSF, chýbal v neutrofiloch katelín-LL-37 a v plazme a slinách nebol zistiteľný; ťažké periodontálne ochorenie mali všetci okrem jedného pacienta po transplantácii kostnej drene, ktorý mal hladiny LL-37 takmer normálne a zdravý periodont. V biopsiách pri atopickej dermatitíde boli LL-37 aj beta-defenzín 2 výrazne nižšie než pri psoriáze a kombinácia oboch peptidov účinne ničila baktérie Staphylococcus aureus, čo zodpovedá náchylnosti atopickej kože na stafylokokovú infekciu.
V onkologickom výskume sa LL-37 podáva priamo do nádoru. V štúdii fázy 1 u pacientov s kožnými metastázami melanómu dostala 63-ročná žena s melanómom III. C stádia osem týždenných injekcií do lézií a liečené lézie sa medzitým klinicky zmenšovali. Predklinickým základom je aktivácia plazmocytoidných dendritických buniek, ktoré potom sprostredkujú zničenie nádoru.
04Dávkovanie
LL-37 sa v klinických štúdiách podával ako roztok na povrch rany, nie injekčne. Uvedené sú koncentrácie a frekvencie z publikovaných štúdií.
Skúmané dávky
Štúdia prvého podania človeku, 34 pacientov s bércovým vredom
obtiažne sa hojace venózne vredy predkolenia
0,5, 1,6 a 3,2 mg/ml
- Podanie
- topicky na povrch rany
- Načasovanie
- dvakrát týždenne
- Trvanie
- 4 týždne, po 3-týždňovej fáze s placebom
Zdroj Grönberg a kol. 2014 ↗
Fáza 2b, 148 pacientov s bércovým vredom, spolu s kompresnou liečbou
obtiažne sa hojace venózne vredy predkolenia
0,5 a 1,6 mg/ml
- Podanie
- topicky na povrch rany
- Načasovanie
- dvakrát týždenne
Zdroj Mahlapuu a kol. 2021 ↗
Prehľad dávok z registrácií, klinickej praxe a štúdií; pri každej je uvedený zdroj. Slúži na vzdelávanie, nie ako individuálny protokol.
05Riziká a súvislosti
V klinických štúdiách sa LL-37 podával na povrch rany: 34 pacientom v štúdii prvého podania človeku, 148 pacientom v štúdii fázy 2b s bércovými vredmi a pacientom s vredom pri syndróme diabetickej nohy; v štúdii fázy 1 pri melanóme sa podával injekčne do lézií.
V klinických štúdiách s roztokom na kožu bol LL-37 bezpečný a dobre znášaný: v štúdii prvého podania človeku autori neuvádzajú miestne ani systémové bezpečnostné signály a v štúdii fázy 2b bol liek dobre znášaný v oboch koncentráciách. Hojenie pritom nebolo lineárne od dávky: najvyššia koncentrácia 3,2 mg/ml sa od placeba nelíšila, zatiaľ čo dve nižšie koncentrácie hojenie zrýchlili.
Pri priamom podaní do nádoru sú opísané kožné reakcie. U 63-ročnej pacientky, ktorá v štúdii fázy 1 dostala osem týždenných injekcií LL-37 do melanómových lézií, sa približne 45 dní po začatí liečby objavili viaceré verukózne papuly a vezikulobulózna lézia na trupe a končatinách; z 12 biopsií malo 11 ten istý obraz lichenoidného infiltrátu s eozinofilmi a atypickej skvamóznej proliferácie. Všetky lézie sa do dvoch mesiacov po skončení injekcií upravili.
Pri vysokých koncentráciách peptid poškodzuje aj ľudské bunky: v pufrových podmienkach in vitro je LL-37 pri 13–25 µM cytotoxický pre viaceré eukaryotické bunky, kým v prítomnosti ľudského séra sa táto aktivita aj antibakteriálny účinok tlmia. Nadbytok vlastného katelicidínu má svoj podiel na dvoch kožných ochoreniach. Pri psoriáze je LL-37 v povrchovej epiderme hojný, mení inertnú vlastnú DNA na podnet pre receptor TLR9 v plazmocytoidných dendritických bunkách a v dvoch tretinách pacientov so stredne ťažkou až ťažkou plakovou psoriázou sa nachádzajú T-lymfocyty špecifické práve preň, pričom ich prítomnosť v krvi koreluje s aktivitou ochorenia. Pri rozacei je hladina katelicidínu v koži tváre vysoká a tryptický enzým rohovej vrstvy ho štiepi na odlišné peptidy než u zdravých ľudí. Keď tieto peptidy podali myšiam do kože, zápal stúpol, a u myší bez génu Camp sa nezvýšil.
06Ako zapadá do celku
LL-37 patrí k vrodenej imunite a v archíve stojí vedľa peptidov, ktoré zápalovú odpoveď naopak tlmia: KPV je protizápalový koniec hormónu alfa-MSH. Na keratinocyty pôsobí LL-37 cez receptor epidermálneho rastového faktora, teda cez tú istú dráhu, ktorú aktivuje EGF; v koži sa tak obe molekuly stretávajú pri migrácii keratinocytov a reepitelizácii.
Jeho tvorba závisí od vitamínu D: gén CAMP je priamym cieľom receptora vitamínu D, takže hladina vitamínu D ovplyvňuje, koľko katelicidínu telo dokáže vytvoriť.
Štúdie a zdroje
- Treatment with LL-37 is safe and effective in enhancing healing of hard-to-heal venous leg ulcers: a randomized, placebo-controlled clinical trial. ↗First-in-man trial, 34 patients with venous leg ulcers: 3-week open-label placebo run-in, then 4 weeks of twice-weekly LL-37 at 0.5, 1.6 or 3.2 mg/mL or placebo and 4 weeks of follow-up; healing rate constants about sixfold (0.5 mg/mL, p = 0.003) and threefold (1.6 mg/mL, p = 0.088) above placebo, mean ulcer area down 68 % and 50 %; 3.2 mg/mL no different from placebo; no local or systemic safety concerns.
- Evaluation of LL-37 in healing of hard-to-heal venous leg ulcers: A multicentric prospective randomized placebo-controlled clinical trial. ↗HEAL LL-37, phase 2b double-blind randomized trial, 148 patients with hard-to-heal venous leg ulcers (mean age 67.6 years, median ulcer duration 20.3 months, mean wound area 11.6 cm2): LL-37 0.5 or 1.6 mg/mL with compression versus placebo; no significant improvement in the full population, significant improvement in several interrelated healing parameters in the post hoc subgroup with wounds of at least 10 cm2; well tolerated and safe at both strengths; the drug is developed under the non-proprietary name ropocamptide by Promore Pharma.
- Efficacy of LL-37 cream in enhancing healing of diabetic foot ulcer: a randomized double-blind controlled trial. ↗Randomized double-blind trial in Jakarta (NCT04098562), LL-37 cream versus placebo twice weekly for 4 weeks in diabetic foot ulcers with mild infection: baseline wound-fluid LL-37 low in both arms (1.07 and 1.11 ng/mg protein), greater rise in granulation index on days 7, 14, 21 and 28 (p = 0.031, 0.009, 0.006, 0.037); IL-1alpha and TNF-alpha not reduced and aerobic bacterial colonisation not significantly reduced.
- Dermatologic toxicity from novel therapy using antimicrobial peptide LL-37 in melanoma: A detailed examination of the clinicopathologic features. ↗Case within a phase 1 trial of intratumoral LL-37 injections for cutaneous melanoma metastases: 63-year-old woman with stage IIIC melanoma, 8 weekly injections with interval clinical shrinkage of the injected lesions; about 45 days after the start, multiple verrucous papules and a vesiculo-bullous lesion, 11 of 12 biopsies with a lichenoid infiltrate with eosinophils and atypical squamous proliferation; all lesions resolved within 2 months of stopping; preclinical basis is activation of plasmacytoid dendritic cells.
- Deficiency of antibacterial peptides in patients with morbus Kostmann: an observation study. ↗Six patients with severe congenital neutropenia (morbus Kostmann) on G-CSF versus 22 healthy controls: neutrophils deficient in cathelin-LL-37 and with reduced alpha-defensins HNP1-3, no cathelin-LL-37 detectable in plasma or saliva, severe periodontal disease in all except the bone-marrow transplanted patient, who had near-normal LL-37 and normal dental status.
- Endogenous antimicrobial peptides and skin infections in atopic dermatitis. ↗Skin biopsies in psoriasis, atopic dermatitis and normal skin: abundant LL-37 and HBD-2 in psoriatic epidermis, significantly lower immunostaining and mRNA in acute and chronic atopic lesions (p = 0.006 and 0.03); LL-37 with HBD-2 killed Staphylococcus aureus synergistically.
- Plasmacytoid dendritic cells sense self-DNA coupled with antimicrobial peptide. ↗Human plasmacytoid dendritic cells: LL-37 converts inert self-DNA into a trigger of type I interferon production by forming aggregated, condensed complexes retained in early endocytic compartments that activate Toll-like receptor 9; identified as the key factor mediating pDC activation in psoriasis.
- The antimicrobial peptide LL37 is a T-cell autoantigen in psoriasis. ↗Two-thirds of patients with moderate-to-severe plaque psoriasis harbour CD4+ and/or CD8+ T cells specific for LL-37; these cells produce interferon gamma and Th17 cytokines, infiltrate lesional skin and their presence in blood correlates significantly with disease activity.
- Increased serine protease activity and cathelicidin promotes skin inflammation in rosacea. ↗Facial skin in rosacea: abnormally high cathelicidin levels and differently processed cathelicidin peptides, linked to increased stratum corneum tryptic enzyme; injecting the rosacea peptide forms, adding the enzyme or deleting Spink5 each increased inflammation in mouse skin, and deletion of Camp prevented it.
- Conformation-dependent antibacterial activity of the naturally occurring human peptide LL-37. ↗Circular dichroism and antibacterial assays: disordered in water, helical with bicarbonate, sulfate or trifluoroacetate and in plasma, intracellular and interstitial ion compositions; helicity correlates with activity against Gram-positive and Gram-negative bacteria; minimal inhibitory concentration against E. coli 5 µM, cytotoxic to several eukaryotic cells at 13-25 µM, both activities inhibited by human serum.
- The cathelicidin anti-microbial peptide LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in chronic ulcer epithelium. ↗Human skin in vivo and organ-cultured ex vivo: hCAP18 rises after wounding with a maximum at 48 h and falls to pre-injury levels on closure, is present in the migrating epithelium, is low in chronic ulcers and absent from ulcer-edge epithelium; affinity-purified antibodies against LL-37 inhibited re-epithelialization concentration-dependently and abolished Ki67 staining.
- Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. ↗Human keratinocytes: 1 µg/mL LL-37 gave maximal migration in the Boyden chamber and phosphorylated EGFR within 10 min; OSU8-1, CRM197, anti-EGFR 225 and AG1478 blocked migration, showing HB-EGF-mediated EGFR transactivation, and a dominant-negative STAT3 or SOCS1/SOCS3 abolished it.
- An angiogenic role for the human peptide antibiotic LL-37/hCAP-18. ↗LL-37 induces angiogenesis through formyl peptide receptor-like 1 on endothelial cells: neovascularization in the chorioallantoic membrane assay and in a rabbit hind-limb ischaemia model, direct endothelial proliferation and vessel-like structures in culture, and decreased wound vascularization in mice deficient in CRAMP, the murine homologue.
- In vitro and in vivo wound healing-promoting activities of human cathelicidin LL-37. ↗Human HaCaT keratinocytes: LL-37 activates migration with actin dynamics, focal adhesion kinase and paxillin phosphorylation, Snail and Slug induction, matrix metalloproteinases, MAP kinase and PI3K/Akt signalling, EGFR transactivation and FPRL-1 induction; adenoviral transfer of LL-37 to excisional wounds in ob/ob mice significantly improved re-epithelialization and granulation tissue formation.
- Toll-like receptor triggering of a vitamin D-mediated human antimicrobial response. ↗Human macrophages: Toll-like receptor activation up-regulated the vitamin D receptor and the vitamin D-1-hydroxylase genes, induced cathelicidin and killed intracellular Mycobacterium tuberculosis; sera with low 25-hydroxyvitamin D supported cathelicidin mRNA induction inefficiently.
- Human cathelicidin antimicrobial peptide (CAMP) gene is a direct target of the vitamin D receptor and is strongly up-regulated in myeloid cells by 1,25-dihydroxyvitamin D3. ↗1,25-dihydroxyvitamin D3 and three analogues induced CAMP expression in myeloid leukemia, immortalized keratinocyte and colon cancer lines and in normal human bone-marrow macrophages, through a consensus vitamin D response element in the CAMP promoter bound by the vitamin D receptor; the element is conserved in primates and absent in mouse, rat and dog.
- LL-37, the only human member of the cathelicidin family of antimicrobial peptides. ↗Review: LL-37 is a 37-residue amphipathic helical peptide cleaved from hCAP18, expressed in epithelial cells of testis, skin, gastrointestinal and respiratory tract and in monocytes, neutrophils, T, NK and B cells; roles in regulating inflammation, chemo-attracting adaptive immune cells to wound and infection sites, binding and neutralizing LPS and promoting re-epithelialization and wound closure.
- A comprehensive summary of LL-37, the factotum human cathelicidin peptide. ↗Review of LL-37: antibacterial, antifungal and antiviral activity, chemotactic and immunomodulatory effects, induction of wound healing and angiogenesis, modulation of apoptosis and a discussed role in cancer.
Súvisiace látky
Thymosin alpha-1 Glutathione KPV BPC-157 Epidermal growth factor